Observação de Células Vivas ao Microscópio: A Microscopia de Luz com Contraste de Fase e seu Papel na Cultura Celular
A Revista Eletrônica PesquisABC possui o seguinte registro ISSN: 2675-1461
Andressa Francine Martinsª, Emily Hajdu Tanimura b, Felipe Nogueira Ambrósio c, Jaqueline Martins Badanaiª, Jurandir da Silva Juniorª, Natália Ferro Passoniª, Christiane Bertachini Lombelloª,b
a Pós-Graduação em Engenharia Biomédica (PPGEBM), Universidade Federal do ABC (UFABC)
b Graduação em Engenharia Biomédica (EBM), Universidade Federal do ABC (UFABC)
c Pesquisador Colaborador, Universidade Federal do ABC (UFABC)
Resumo: A microscopia de luz por contraste de fase é uma técnica óptica fundamental na observação de células vivas e estruturas biológicas transparentes, especialmente em culturas celulares. Ao dispensar o uso de fixadores e corantes, essa abordagem preserva a integridade da amostra e permite o acompanhamento dinâmico de processos celulares como adesão, proliferação e diferenciação. Seu princípio baseia-se na conversão de variações de fase da luz em diferenças de intensidade desta, revelando detalhes morfológicos invisíveis na microscopia convencional. Essa técnica tem se destacado em áreas como engenharia de tecidos, microbiologia e desenvolvimento de terapias avançadas. Comparada a outras técnicas a microscopia de luz com contraste de fase oferece uma solução de menor custo e alta aplicabilidade em laboratórios de ensino e pesquisa. Suas aplicações incluem desde o monitoramento da morfologia celular e viabilidade até o ensino de técnicas básicas de imagem de microscopia. O contínuo aprimoramento dos sistemas ópticos reforça seu papel como ferramenta essencial na pesquisa biomédica contemporânea.
Palavras-chave: células; microscopia de contraste de fase; engenharia de tecidos; técnicas de cultura celular; viabilidade celular.
Abstract: Phase contrast light microscopy is a key optical technique for observing live cells and transparent biological structures, particularly in cell culture. By eliminating the need for dyes or fixatives, this method preserves sample integrity and enables dynamic monitoring of cellular processes such as adhesion, proliferation, and differentiation. Its core principle involves converting phase shifts in light into intensity variations, revealing morphological details that conventional microscopy cannot detect. Widely applied in tissue engineering, microbiology, and advanced therapy development, this technique stands out for its ability to provide real-time analysis without altering biological samples. Compared to other techniques, light microscopy with phase contrast remains a cost-effective and accessible solution for many laboratories. Applications range from assessing cell viability to training students in optical imaging. Ongoing improvements in optical systems underscore its relevance as an essential tool in modern biomedical research.
Keywords: cell culture techniques; cell viability; cell; phase contrast microscopy; tissue engineering; live cell imaging.
CB Lombello ORCID: 0000-0002-4927-7292
AF Martins ORCID: 0009-0006-1196-1431
Emily Hajdu Tanimura ORCID: 0009-0002-0102-5149
Felipe Nogueira Ambrósio ORCID: 0000-0002-8005-3772
Jaqueline Martins Badanai ORCID: 0009-0002-6311-4817
Jurandir da Silva Junior ORCID: 0009-0005-6530-7032
Natália Ferro Passoni ORCID: 0009-0000-6661-0838
Introdução
Em 1953, o físico holandês Frits Zernike recebeu o Prêmio Nobel de Física pela invenção da microscopia de luz com contraste de fase. Essa técnica avançada de microscopia óptica tem como principal característica proporcionar a visualização de células vivas e organismos microscópicos sem a necessidade de utilização de substâncias fixadoras ou corantes, que podem interferir com os tipos celulares presentes no meio de cultura e destruir a integridade das amostras biológicas a serem analisadas [1]. Em virtude disso, essa técnica permite visualizar a morfologia (ou formato) das células vivas, em tempo real, sem prejudicar a sua sobrevivência, e por esse motivo essa tecnologia é amplamente utilizada para observar culturas celulares, ou seja, células mantidas em sistemas in vitro, fora dos organismos. Além da morfologia, também é possível observar e a interação das células com outras, próximas, ou com o substrato no qual são cultivadas, com nitidez [2].
Ao contrário da microscopia convencional, microscopia de luz direta, na qual a luz atravessa diretamente o material em observação, a microscopia com contraste de fase se utiliza da interação entre a luz, os materiais biológicos analisados e o meio aquoso ao redor, para a observação com uma delimitação mais precisa dos contornos celulares e estruturas como núcleo, através do realce (ou contraste) das diferentes densidades presentes nas amostras. Na área de cultura de células e engenharia de tecidos a microscopia por contraste de fase se apresenta como uma ferramenta de importância fundamental para observar como as células desempenham suas atividades de de adesão, crescimento, proliferação e diferenciação em resposta a diferentes estímulos, como o contato com biomateriais ou a resposta a biomoléculas, já que permite que esses processos celulares sejam analisados com maior eficiência, promovendo o avanço da pesquisa básica e aplicada [3]. Avanços recentes têm expandido sua aplicação para a análise dinâmica de estruturas biológicas tridimensionais, como esferoides e organoides e modelos de câncer, destacando sua crescente relevância na pesquisa da medicina translacional e no desenvolvimento de terapias inovadoras [4].
Princípios do Contraste de Fase
A microscopia de luz por contraste de fase é uma técnica que permite a observação de amostras biológicas transparentes sem que haja necessidade de tratamento com corantes, revelando estruturas morfológicas que, de outra forma, permaneceriam invisíveis. O princípio em que a técnica se baseia é a manipulação de pequenas variações na fase da luz, causada por diferenças de densidade e índice de refração da amostra [2, 5]. Esse processo envolve uma sequência coordenada de componentes ópticos, como ilustrado na Figura 1. Um microscópio de contraste de fase, além dos componentes básicos de um microscópio óptico, possui um diafragma anular e uma placa de difração para gerar contraste em amostras transparentes e pouco contrastadas [2].
Figura 1. Esquema da configuração do microscópio de contraste de fase: (A) Fonte de luz; (B) Diafragma anular; (C) Condensador; (D) Amostra; (E) Objetiva; (F) Luz com fase alterada; (G) Placa modificadora de fase. Os autores, 2025.
O processo começa com a fonte de luz (A), geralmente são lâmpadas halógenas ou de LED de amplo espectro, que emitem luz branca contínua. A luz então atravessa o diafragma anular (B), uma abertura circular oca que cria um cone de luz focado. Em seguida, a luz passa pelo condensador (C), que foca o anel luminoso de forma precisa sobre a amostra. A amostra (D), por exemplo uma célula viva, interage com a luz incidente. A luz atravessa a amostra diretamente na ausência de material, enquanto é desviada ao passar por organelas com diferentes índices de refração. Isso gera uma diferença de fase entre os dois caminhos de luz: o feixe não desviado mantém sua forma original, enquanto o feixe difratado sofre um leve atraso (F). Esses dois feixes seguem para a lente objetiva (E), em que são coletados e direcionados à formação da imagem. Nesse tipo de microscópio, a objetiva contém uma placa modificadora de fase (G), que impõe um atraso adicional ao feixe direto, geralmente de um quarto de comprimento de onda. Esse ajuste provoca a interferência entre os dois feixes e resulta em regiões de maior ou menor intensidade luminosa [2, 5]. A interferência óptica transforma as sutis diferenças de fase (da luz), originalmente invisíveis, em variações de brilho detectáveis formando uma imagem com contraste evidente entre componentes celulares (Figura 2).
Figura 2. Células Vero em cultura, observada por microscopia de luz com contraste de fase: (A) Células em suspensão, morfologia arredondada; (B) Células aderidas ao substrato, morfologia poligonal e alongada. Os autores, 2025.
Tipos de Configuração de Contraste de Fase
A microscopia de contraste de fase utiliza o princípio físico do fenômeno de interferência, em que dois feixes de luz coerente se encontram após atravessarem trajetórias ópticas distintas. Caso a onda esteja em fase, a interferência é construtiva (Figura 3A), intensificando a luz resultante. Já quando as ondas estão defasadas, ocorre interferência destrutiva (Figura 3B), diminuindo ou até mesmo anulando a intensidade luminosa. A maneira como essa interferência é manipulada define as configurações ópticas possíveis, sendo as principais contraste de fase positivo e contraste de fase negativo [5, 6].
Figura 3. Interferência de ondas: (A) Construtiva; (B) Destrutiva. Comparação de configurações de microscopia de luz com contraste de fase para observação de eritrócitos humanos: (C) Contraste de fase positivo; (D) Contraste de fase negativo. Fonte: Os autores (A,B); Nikon, MicroscopyU (C, D) [8].
No contraste de fase positivo (Figura 3A), a luz que atravessa a amostra sem sofrer desvio é submetida a um atraso de um quarto de comprimento de onda, realizado pela placa modificadora de fase na objetiva. Em contraste, a luz difratada pelas estruturas celulares se mantém inalterada. A recombinação desses dois feixes de luz no plano da imagem origina a interferência destrutiva em regiões que ocorrem variações estruturais, o que resulta no escurecimento dessas áreas em relação ao fundo iluminado. Essa configuração é mais utilizada, pois proporciona um contraste eficiente e preserva a morfologia da amostra [7].
E no contraste de fase negativo (Figura 3B), o princípio é invertido, a placa modificadora de fase atua sobre a luz difratada, retardando-a em relação à luz não desviada. Como resultado, é gerado a interferência construtiva nas regiões onde há estruturas celulares, isso torna as áreas mais claras em relação ao fundo escuro (Figura 3C e 3 D). Embora essa configuração seja menos frequente, este contraste pode ser benéfico em situações que se busca minimizar artefatos ópticos, como halos, ou evidenciar regiões específicas com maior intensidade de luz [7].
Vantagens e Limitações
O microscópio luz com contraste de fase permite a observação de células vivas, sem a necessidade de processos que normalmente implicam em morte celular, como o uso de fixadores e corantes. Com isso é possível acompanhar a observação de cultura de células em tempo real para o acompanhamento de fenômenos dinâmicos, como a mitose celular. Isso é possível graças à sua capacidade de conferir contraste aos contornos e estruturas celulares, como núcleo, que em um microscópio convencional, de luz direta, seriam invisíveis ou de observação muito difícil (Figura 4) [2. 5, 9]. As amostras observadas ao microscópio de luz com contraste de fase não requerem preparos especiais, sua observação pode ser feita de forma rápida e fácil, no entanto para o acompanhamento das culturas celulares é necessário que o microscópio seja invertido, permitindo a observação de garrafas e placas onde as células são cultivadas [9, 10].
Figura 4. Comparação entre imagens de células em cultura bidimensional: (A, C) com contraste de fase; (B D) sem o contraste de fase. Setas evidenciam artefatos de halos brilhantes ao aplicar contraste. Os autores, 2025.
Porém o uso do contraste de fase apresenta algumas limitações que precisam ser levadas em conta no momento de escolha de como observar uma amostra, como o surgimento de halos brilhantes em certas estruturas, como amostras espessas ou culturas densas, gerando artefatos que podem dificultar a interpretação de uma imagem (Figura 4 C, D). Para superar essa limitação, técnicas de correção de halo em tempo real têm sido desenvolvidas, aprimorando a qualidade das imagens e a precisão das análises morfológicas celulares [11].
Além disso, a técnica é eficaz apenas em amostras finas, uma vez que em amostras espessas os efeitos de fase se sobrepõem, tornando a imagem turva e não fornece informações químicas ou moleculares das amostras, sendo uma técnica sem especificidade. Por fim, a técnica requer um equipamento de microscópio adaptado, com lentes objetivas e condensador próprios para contraste de fase, o que representa um custo adicional significativo para qualquer laboratório que deseje realizar este tipo de microscopia [9-12].
Aplicações Práticas
Em relação a aplicação prática, a técnica de microscopia de luz com contraste de fase é utilizada para o estudo de conceitos fundamentais da biologia celular, uma vez que permite a avaliação de células vivas, sem coloração. Em cultura celular é possível utilizar essa técnica para a análise do crescimento, da morfologia, da viabilidade e da migração celular, ou o desenvolvimento de vacinas, teste de medicamentos e dispositivos médicos [10, 12].
Além disso, também é possível utilizar a microscopia de contraste de fase para a classificação de espécies de microrganismos, como bactérias, com precisão e a análise em tempo real do seu crescimento, e susceptibilidade a antibióticos, sem a necessidade de técnicas de fluorescência [12]. Técnica que também pode ser aplicada no estudo de células microbianas e como elas respondem a estímulos externos, como mudança de pH, temperatura e disponibilidade de nutrientes [13]. Ainda, é um tipo de microscopia utilizada para treinar estudantes sobre técnicas de imagens, tornando-a uma ferramenta para o ensino dos princípios da microscopia óptica e da análise de imagens [12].
No laboratório de Engenharia de Tecidos e Biomoléculas da UFABC a técnica de microscopia de luz com contraste de fase é amplamente utilizada para o acompanhamento das linhagens celulares cultivadas e para análises de citotoxicidade como apresentado na Figura 5 [14, 15].
Figura 5. Ensaio de citotoxicidade avaliado por microscopia de luz com contraste de fase: (A) Controle negativo com padrão de cultivo das células Vero; (B) Citotoxicidade negativa frente a biomaterial de PLA, com morfologia semelhante ao controle negativo. Os autores, 2025.
Tendências e Inovações
Nos últimos anos as inovações em microscopia de contraste de fase visam melhorar a qualidade das imagens, aumentar a eficiência operacional e expandir as aplicações dessa técnica em diversas áreas científicas. Um dos avanços notáveis é o desenvolvimento do condensador SI-PH (Nikon), lançado em maio de 2024, que permite a transição suave entre observações em campo claro e contraste de fase, além de facilitar a troca de ampliações sem a necessidade de substituir componentes ópticos, otimizando o processo de observação em ambientes de pesquisa e ensino. Outro destaque é a introdução da microscopia de contraste de fase diferencial com polarização (pDPC), que utiliza câmeras sensíveis à polarização para capturar registros de fase em uma única exposição, oferecendo uma solução robusta e de baixo custo para a obtenção de imagens quantitativas. Essas inovações refletem a tendência crescente de integrar tecnologias avançadas para tornar a microscopia de contraste de fase cada vez mais acessível, precisa e eficiente [16-18].
Conclusão
A microscopia de contraste de fase pode ser definida como uma das técnicas mais importantes utilizadas na observação de células vivas e amostras biológicas em cultura, possibilitando a análise detalhada de estruturas sem a necessidade de fixação, coloração ou outros preparos. Além disso, seu princípio óptico baseado na interferência de luz com diferentes fases possibilita a sua aplicação em áreas como engenharia de tecidos e microbiologia. Apesar das suas limitações, como a formação de artefatos ópticos, os avanços tecnológicos vêm melhorando a sua aplicabilidade e a qualidade da imagem, tornando-a uma ferramenta versátil no ensino de biologia e na pesquisa científica.
Referências Bibliográficas
1. Sluder, G. & Nordberg, J. J. Microscope basics. Methods Cell Biol. 114, 1-10 (2013).
2. Centonze, F. V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J. Vis. Exp. 17, 844 (2008).
3. Murphy, D. B. & Davidson, M. W. Fundamentals of light microscopy and electronic imaging. (Wiley‐Blackwell, 2012).
4. Liu, C., Shi, C., Wang, S., Qi, R., Gu, W., Yu, F., Zhang, G. & Qiu, F. Bridging the gap: how patient-derived lung cancer organoids are transforming personalized medicine. Front. Cell Dev. Biol. 13, 1554268 (2025).
5. Marchi, E. & Castro D. M. Revisão de Microscopia. 2ª ed. (Lavras: Editora UFLA, 2005).
6. Murphy, D., Oldfield, R., Schwartz, S. & Davidson, M. W. Introduction to Phase contrast microscopy. [online] Available at:microscopyu.com/techniques/phase-contrast/introduction-to-phase-contrast-microscopy. (Accessed 29 Abr. 2025).
7. Pluta, M. Advanced Light Microscopy: Specialized Methods. Vol. 2, 30-42 (Elsevier, 1989).
8. Nikon, MicroscopyU. Phase Contrast. [online] Available at: https://www.microscopyu.com/galleries/phase-contrast. (Accessedo 29 Abr. 2025).
9. Ockenga, W., DeRose, J. & Greb, C. Phase Contrast and Microscopy. [online] Available at: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/microscopy-basics/phase-contrast-and-microscopy (Accessed em: 29 Abr. 2025).
10. Johnson, S. A. Chapter 1 .Phase Contrast microscopy. In: Biomedical optical phase microscopy and nanoscopy, 3-18 (Academic Press, 2013).
11. Kandel, M. E., Fanous, M., Best-Popescu. C., & Popescu, G. Real-time halo correction in phase contrast imaging. Biomed. Opt. Express. 9, 623-635 (2018).
12 Masters, B. R. Phase Microscopy to enhance contrast. Springer Series in Optical Sciences, 227 (Springer Cham, 2020).
13. Hallström, E. et al. Label-free deep learning-based species classification of bacteria imaged by phase-contrast microscopy. BioRxiv. 540740 (2023).
14. Nascimento, M. H. M., Ferreira, M., Malmonge, S. M. & Lombello, C. B. Evaluation of cell interaction with polymeric biomaterials based on hyaluronic acid and chitosan. J. Mater. Sci. Mater. Med. 28, 68 (2017).
15. Nascimento, M. H. M., Franco, M. K. K. D., Yokaichyia, F., de Paula, E., Lombello C.B. & de Araujo, D. R. Hyaluronic acid in Pluronic F-127/F-108 hydrogels for postoperative pain in arthroplasties: Influence on physico-chemical properties and structural requirements for sustained drug-release. Int. J. Biol. Macromol. 111, 1245-1254 (2018).
16 Nguyen, T., Pradeep, S., Judson-Torres, R. L., Reed, J., Teitell, M. A., & Zangle, T. A. Quantitative phase imaging: recent advances and expanding potential in biomedicine. A.C.S. Nano. 16, 11516–11544 (2022).
17. Nikon Corporation. New SI-PH condenser for easy phase contrast and brightfield switching, (2024). [online] Available at: https://www.healthcare.nikon.com/en/news/topics/20240528001.html. (Accessed em Acesso 29 Abr. 2025).
18. LIU, H., KUMAR, S., GARCIA, E., FLANAGAN, W., LIGHTEY J. & DUNSBY C., & French, P. M. W. Open-source implementation of polarisation-resolved single-shot differential phase contrast microscopy (pDPC) on a modular openFrame-based microscope. HardwareX 21, e00622 (2025).
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